和同治帝一样，光绪帝正当盛年时却突然死去，成为慈禧垂帘听政之下的第二个牺牲品，而且他的死与慈禧的死仅相差一天。因而，关于他的死因也就引起了世人的种种猜测。
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第一种观点认为光绪是患重病而死。在废立风波中，光绪依旧做他的皇帝，但他的实权却丢了，精神也备受打击。光绪帝重重的顾虑极大地影响了他的健康。另外光绪帝自幼孱弱，脾胃素来虚弱。光绪虽贵为天子，却连一个孤儿也不如。
据宫中太监寇连材日记说，当时宫中人受各种限制，不能亲近光绪。惟有西太后可以亲近他，而她当时骄奢淫逸，对光绪的生活根本不管。小皇帝每天有数十种菜，但菜皆不能入口。光绪要加菜，御膳房必先告知太后，慈禧必然责备他铺张浪费，不懂节俭，光绪只好从小挨饿。
光绪在这种情况下，很容易患上重病。《清德宗实录》、《清史稿》、《光绪朝乐华录》等都说光绪久病体虚，至光绪三十四年病入膏肓，最后驾崩，但这些均为官方文件，可信度不一定高。
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第二种说法最为流行，说是慈禧谋害了光绪帝。持这种观点者认为光绪虽然长期被囚，保皇党却极依靠他。慈禧自己身体健康，能执政时，百般折磨光绪。晚年，她力不从心了，便想害死他。当时因担任起居注官而能接近光绪的恽毓鼎，写了一部《崇陵存信录》(又名《光绪外传》)，记录了光绪临死前的状况：光绪三十四年(公元1908年)秋忽然传出病重消息，召京外名医入宫诊视。诊脉时，光绪静静地把双手置案上，自己写出病情。
入诊者都说光绪身体尚健。十月初十，逢慈禧万寿节(生日)，光绪出瀛台，替太后祝寿，有人看见他为准备跪拜而活动筋骨。十九日，宫廷大乱，增加侍卫，稽查出入，传言光绪驾崩。次日，宫中恢复了宁静，午后，传载沣监国、溥仪入宫教养之命。二十一日，皇后入瀛台探视，光绪早已气绝身亡。太后闻此，仅叹息几声。
在这则记录里，恽毓鼎实际上暗示慈禧害死了光绪。而且，慈禧宣布光绪病重，和百日维新后废立风波之做法一样。恽氏长期任起居注官，他的话具有一定的可信度。
而曾在宫中担任女官的德龄女士，则在《清宫二年记》等书中，明确地指明正是李莲英下毒害死了光绪。
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以上三种说法都是言之凿凿，但是清宫太监回忆录《清宫琐谈》则说光绪实则死于饥饿。据载，光绪本无大病，诸医开方皆以平和之剂为药，然而，太监们在光绪死前已得到光绪驾崩的消息。当时，在瀛台侍疾者共六名，其中二人饿死，剩下几人食不果腹，“因饿失血者又凡三人”。光绪死前，在床上召唤医生周某，他两眼瞪大，四次用手指口，周某知帝饿急，但实在是没有吃的，就连他本人也三天未进食了。后来，光绪便渐无声息了。不久，醇亲王入见，周报告说皇上已去世，醇亲王用镜子试皇上气息，确信其已死亡，于是匆匆而去。一会儿，皇后赶来探视，随后便把皇上驾崩的消息公之于世。
在这几种说法里，究竟哪种说法的可信度更高一些，让人难以取舍。光绪帝之死与同治帝之死一样，成为清宫内又一未解之谜。